生命的奥秘：基因测序的前世今生
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时间：2014-11-10 来源: 丁香通 作者：佚名 点击：1846
DNA测序技术自发明以来就一直在推动分子生物学发展方面起着至关重要的作用。从早期FrederickSanger的手工测序，以及基于Sanger法开发的第1代自动化测序仪，到目前的下一代测序平台，这一领域已经发生了巨大的变化。有人甚至将基因组测序技术的发展与半导体技术的发展相提并论，这也不无道理——在过去的数十年中，每经过几年，测序速度就呈指数增长，与半导体工业发展的摩尔定律(Moore’slaw)非常相似。这种高速的发展，从根本上改变了人们研究所有生命蓝图的方式并且推动了基因组学及其分支乃至其他密切相关学科的创立与发展。
在第一台全自动测序仪出现之前，使用最为广泛的测序方法就是 Sanger 在 20 世纪 70 年代中期发明的末端终止法测序技术。 Sanger 也因此获得 1980年的诺贝尔化学奖。他的发明第一次为科研人员开启了深入研究生命遗传密码的大门。
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最早版本的第1代测序仪是20世纪80年代中期在CalTech的LeroyHood芝麻开门交易所发明的。这一测序仪通过修改Sanger法得以实现。最关键的改变是采用具有颜色的荧光染料代替同位素标记。4种双脱氧核苷酸终止子被标记上不同颜色的荧光基团。另外，与最初的Sanger法不同，荧光基是标记在终止子上，而不是在引物上。这种不同颜色标记的方案可以实现一个反应管中同时进行4个末端终止反应。采用聚丙烯酰胺凝胶分离，并通过计算机荧光检测系统分析梯状反应产物。这些改进极大地提高了测序速度，减少了测序过程中的人为干扰。次年，利用LeroyHood芝麻开门交易所的技术，ABI推出了第一款半自动DNA测序仪ABI370。在随后的20年中，测序仪的性能得到了极大的提升。但基本工作原理直到最近才有所改变。
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第1代测序仪的第2个版本出现在20世纪末。这一版本的测序仪，其测序速度与质量得到了进一步的提高。这主要归功于两方面的工作:第一，平板电泳分离技术被毛细管电泳所取代;第二，通过更高程度的并行化使得同时进行测序的样本数量增加。使用毛细管替代平板凝胶取消了手工上样，降低了试剂的消耗，提升了分析的速度。另外，紧凑的毛细管电泳设备的形式更易于实现并行化，可以获得更高的通量ABI3730测序仪和AmershamMega-BACE分别可以在一次运行中分析96个或384个样本。这一代测序仪在人类基因组计划DNA测序的后期阶段起到了关键的作用，加速了人类基因组计划的完成。而且由于其在原始数据质量以及序列读长方面具有的优势，这些测序仪今天还在使用之中。
所谓二代测序方法，包括大量基于不同技术的方法. 尽管从模板文库制备、片段扩增到测序，这些方法所采用的技术与生物化学相当多样，但是都采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术——阵列上的DNA样本可以被同时并行分析.此外，测序是利用DNA聚合酶或连接酶以及引物对模板进行一系列的延伸，通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号实现的。
所有的下一代测序平台遵循了类似的工作流程，都要经过克隆扩增以加强测序过程中的光学检测灵敏度。目前已经有3种广泛使用的商业化测序平台平台，它们分别是Illumina的GenomeAnalyzer，罗氏454基因组测序仪以及ABLifeTechnologies的SOLiD系统。它们基本都是在20世纪90年代末被发明和开发出来，在2005年前后商业化。Polonator.G.007是最近刚刚实现商业化的新设备，该仪器最初由哈佛大学GeorgeChurch芝麻开门交易所开发，现在由DoverSystems公司制造。CompleteGenomics公司最近推出了基于其专利技术的测序服务平台，但该公司并没有表示要在市场销售这一设备。这些仪器都采用了合成测序法，只是在DNA阵列的排布、DNA簇扩增，以及基于酶的测序生化反应方面存在差异。
Illumina公司的测序仪采用合成测序法，使用荧光标记的核苷酸以及可逆的终止子。在每一轮测序循环中，标记不同荧光基团的4种核苷酸以及DNA聚合酶同时加入流通池通道中，按照碱基互补配对的原则进行DNA链的延伸。每个核苷酸的3′羟基是被封闭起来，以防止额外的延伸。采集荧光图像，碱基特异的荧光标记揭示了这一轮中新加入核苷酸是什么，也就获得模板中这一位置的DNA序列。然后，打开3′端，继续进行下一轮反应。这一过程重复多次，到50个循环，产生50个碱基的DNA序列。
454测序仪利用微乳滴PCR(emulsionPCR，emPCR)来生成扩增产物。将固化引物的微球与单链DNA文库模板以及必要的PCR反应化合物一起混合，微球与文库片段的比例适当，以确保大多数微球结合的单链DNA分子不超过一个。水溶液与油混合形成油包水结构乳滴。每个乳滴都是一个进行后续PCR反应的微型化学反应器。经过多轮热循环，每个微球表面都结合了数千个相同的DNA拷贝。然后富集微球，转移并放置到刻有规则微孔阵列的微孔板上。每个微孔只能容纳一个微球。微孔板被安装成为流通池的一部分。其中一面可以通过测序反应的化合物，另一面则与CCD光学检测系统的光纤部件相接触。
与454的情况相同，SOLiD系统也采用了微乳滴PCR与微球相结合的策略来扩增DNA模板.打破微乳滴后，扩增微球被收集、富集并固定在一个平的玻璃基板上形成一个无规则的阵列。
Polonator.G.007， Polonator 是另外一款使用连接测序技术的下一代测序仪，它采用的是单碱基探针,而不是上述双碱基编码的策略，测序是通过在结合到经微乳滴PCR扩增的DNA簇上的通用引物与九碱基探针之间的一系列连接反应进行的，每次连接反应,将一个九碱基探针池与DNA连接酶一起加入,以进行引物-探针连接。九碱基探针池中包括很多荧光标记的变性寡核苷酸探针。荧光标记与每个读取位置对应(即荧光颜色与读取位置的碱基相对应)，每次连接之后获取荧光图像，然后,延伸的引物——探针链经变性进行系统重置，接下来,对下一个读取位置进行引物与第2个九碱基探针池之间的连接，这一重置-连接-获取图像的过程重复进行,直到所有位置的信息被读取。
在所有上述第2代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的，除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加，依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大，直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常可取的，在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内，很难准确预测未来将发生什么，但是，最近几个领域大量的研究工作表明未来新一代的测序平台将在其中产生。
最近，日本大阪大学的研究小组发现，在一条拉长的DNA链上，利用扫描隧道显微镜的图像，根据独特的电子指纹，可以将鸟嘌呤与其他3种碱基区分开来。另外一些团队一直积极地致力于使用原子力显微镜来记录将每个碱基紧密连接的环拉开所需力的大小，以区分不同的碱基。而ZSGenetics公司致力于使用电子显微镜直接测序。为了解决天然DNA分子在电子显微镜下对比度不足的问题，他们在聚合酶合成新DNA链时加入更重的元素。在电子显微镜下观察就可以获得的更重的DNA并确定其序列。
顾名思义，纳米孔就是直径在纳米尺度的小孔(1~2nm)。通常是利用固态物质或者生物分子制成的小孔。这种想法是在电场驱动下，当线状DNA分子通过小孔时，通过一些物理手段来确定碱基的序列。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNAElectronics，IBM，NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在进行纳米孔测序的开发，但采用的方法不同。
石墨烯是由碳原子构成的二维晶体，碳原子排列与石墨的单原子层一样。非常稳定并具有非常良好的导电性，非常适合制作核酸测序用电极的材料。有种设想是在石墨烯上打出一个大约1nm宽的缝隙。引导DNA分子垂直通过缝隙。当DNA通过时，缝隙两边的石墨烯边缘可以作为电极来确定核酸的序列。除了在石墨烯上打出这样一个缝隙是一种挑战之外，控制DNA的运动、移动的方向以及通过缝隙的速度同样是不小的障碍。
30年的创新和发展开创了基因组测序的新时代.测序技术从手工的一次一个样品发展成为基于大规模阵列的高度自动化技术.测序通量呈指数提高,而成本急剧降低.由于当前的以及即将出现的更新一代测序技术,1000美元基因组的目标将变得更加现实.快速、廉价的测序能力将引领我们开辟比较基因组学分析、疾病诊断以及个性化(个体化)医疗等新领.由于其在科研以及经济方面的巨大利益,中国应该在21世纪这一关键技术的研究开发方面发挥更大的作用,并积极促进其在生命科学研究以及医药领域的广泛应用.当全部现存生物的基因组及其有意义的变异都被发现并掌握时,做出这些贡献的人应该感到无比的自豪！